Metoda izolace DNA má vliv na výsledky analýzy mikrobiomu mateřského mléka

Mateřské mléko poskytuje výživu a různé bioaktivní faktory (například imunitní buňky) nezbytné pro vývoj dítěte. Přirozenou součástí mateřského mléka jsou i mikrobiální komunity bakterií a kvasinek. Většina pozornosti se v současnosti věnuje bakteriálním komunitám. Předpokládá se, že mléčná mikrobiota hraje zásadní roli v kolonizaci střev dítěte zdravou symbiotickou mikrobiotou a podílí se na vývoji trávicí soustavy a má i významnou roli ve vývoji imunitního systému. Pro pochopení těchto dějů je nezbytné přesné definovaní složení mléčného mikrobiomu.

Pomocí klasických kultivačních metod lze typicky detekovat jen zlomek mikrobiálních komunit z většiny typů vzorků včetně mateřského mléka. Pomocí kultivačních metod bylo zjištěno, že běžnou součástí mateřského mléka jsou bakterie z rodů Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus Bifidobacterium. Metody používající polymerázovou řetězovou reakci k amplifikaci izolované mikrobiální DNA v kombinaci s různými metodami sekvenování (čtení genetických kódů) umožňují detekci mnohem více bakteriálních druhů. Nejpoužívanější metodou je v současnosti amplifikace a sekvenování univerzálního bakteriálního genu 16S rRNA (amplikonové sekvenování). Tato metoda navíc umožňuje určení relativní početnosti jednotlivých taxonů.

Problémem je, že sekvenování je v případě mateřského mléka stále relativně mladá metoda. Chybí jednotné postupy pro izolaci DNA a její analýzu. Příkladem mohou být dvě studie, které definovaly takzvaný jádrový mikrobiom mateřského mléka. Jádrový mikrobiom je obvykle definován jako taxony vyskytující se ve všech nebo v naprosté většině testovaných vzorků. Jedna studie publikovala jádrový mikrobiom se sedmi a druhá s devíti taxony. Mezi oběma studiemi se shodovaly pouze tři taxony: Propionibacterium, Staphylococcus, Streptococcus. V obou případech šlo převážně o ženy evropského původu z vyspělých zemí, takže je nepravděpodobné, že by tento výsledek byl důsledkem geografické nebo sociální variability ve složení mikrobiomu, i když může jít o artefakt malého počtu vzorků.

Možnou příčinou pro velkou variabilitu v sekvenačních studiích mléčného mikrobiomu je používání různých metod izolace DNA. V současnosti se používají různé metody pro izolaci bakteriální DNA. Nejdůležitějším krokem je rozbití nebo rozložení bakteriálních buněk a uvolnění bakteriální DNA. Toho lze dosáhnout několika metodami, které se běžně různě kombinují. První metodou je působení vysoké teploty, další je použití různých enzymů a chemických látek, které rozkládají buněčné stěny a proteiny bakterií. Další možnost je mechanické rozbití buněčných stěn, to se typicky provádí tak, že se směs buněk v tekuté suspenzi třepe s přidanými tvrdými kuličkami. Rozbíjecí kuličky do sebe opakovaně naráží a drtí mezi sebou buněčné stěny bakterií.

Nová studie testovala jestli metoda izolace DNA ovlivní analýzu složení bakteriálního mikrobiomu mateřského mléka. Vědci použili pěti běžných izolačních postupů na vzorky falešného mléka a mateřského mléka. Šlo o čtyři komerční kity a jeden manuální postup. Falešné mléko byla směs mateřských mlék, ze kterých byl odstraněn tuk, a zbylá tekutá složka byla přefiltrovaná přes filtr, který odstranil všechny přítomné bakterie. K tomuto sterilnímu mléku byly přidané bakteriální kultury nejběžnějších bakterií mléka o známé koncentraci. Na tomto falešném mléce se testovalo, jestli metoda izolace ovlivní koncentraci DNA, čistotu DNA, amplifikaci bakteriálního genu 16S rRNA a složení mikrobiální komunity zjištěné pomocí amplikonového sekvenování. Stejný postup byl následně použit i pro vzorky mateřského mléka. Izolace byla prováděna pomocí stejných nástrojů a za stejných podmínek. A všechny kroky po izolaci DNA byly pro všechny vzorky identické. Rozdílné výsledky analýzy by tedy měly odpovídat hlavně metodě izolace DNA.

Studie neukázala, že by některá z metod byla ve všech parametrech nadřazená ostatním. Jednotlivé metody se lišily v podstatě ve všech parametrech. V případě falešného mléka se ukázalo, že u 4/5 použitých metod se signifikantně nelišily relativní početnosti bakteriálních taxonů. U páté metody patřila téměř polovina bakteriálních sekvencí jiným bakteriím než, které byly do falešného mléka přidány. Překvapivě šlo zároveň o metodu, která měla nejlepší čistotu izolované DNA. Kontaminace bakteriemi z prostředí byla přítomna i ve všech ostatních vzorcích, i když mnohem méně výrazně. Stejný trend byl pozorován i u skutečného mléka. Mateřskému mléku v této studii vždy dominovaly bakterie rodu Staphylococcus, Streptococcus nebo Pseudomonas.

Studie potvrdila již dříve pozorované trendy. Nižší koncentrace izolované DNA je obvykle spojená s vyšší kontaminací bakteriemi z prostředí. Naopak početnosti bakterií, které jsou přirozenou složkou komunity, s koncentrací DNA rostou. Toho lze využít při rozhodování o tom, jestli jsou zjištěné taxony přirozenou součástí mléka nebo jde o kontaminaci. Další pozorovaný trend je, že všechny izolační postupy vedou k podhodnocení početnosti laktobacilů a streptokoků.

Popisovaná práce se nezaměřovala na zjištění původu kontaminace ani vysvětlení rozdílů mezi metodami. Cílem práce bylo ukázat, že metoda izolace může mít výrazný vliv na výsledky analýzy a vědci musí zohledňovat známá omezení dané metody při vyhodnocování výsledků. Některé současné studie například udávají bakteriální druhy, které jsou známou kontaminací z prostředí, jako běžnou součást mikrobiomu mléka.

Další poznámka, která se netýká přímo této studie, ale studia mléčného mikrobiomu obecně. Mléčný mikrobiom se přednostně studuje kvůli jeho vlivu na zdraví dětí. Větěšina studií se při tom omezuje čistě jen na mikrobiom mléka. Dárkyně mléka si před odběrem typicky mají umýt prso a odstříknout malé množství mléka mimo před vlastním odběrem. Přičemž mikroflóra z kůže bradavky a prsou je také očividným přirozeným zdrojem mikrobiální kolonizace dítěte.

 

Douglas CA, Ivey KL, Lito E et al. DNA extraction approaches substantially influence the assessment of the human breast milk microbiome. Scientific Reports 2020; 10: Article number 123.

<< Ostatní aktuality